Superare i limiti della spettroscopia Raman
Bastano poche, semplici soluzioni per ottenere dati Raman eccellenti. Le tecniche SERS o TERS migliorano la sensibilità e la risoluzione spaziale della diffusione Raman.
La spettroscopia Raman è una tecnica di analisi versatile per la caratterizzazione chimica e strutturale. Prenderemo in esame una serie di difficoltà e svantaggi che si possono incontrare durante l'analisi Raman e le soluzioni a quei problemi. Verranno inoltre evidenziati i fattori che influenzano la risoluzione spaziale. Per ottenere una risoluzione spaziale a livello di nanometri, è possibile ricorrere alla tecnica TERS (spettroscopia Raman potenziata dalla punta).
Sfide e considerazioni da valutare nell'applicazione della spettroscopia Raman
La spettroscopia Raman offre molti vantaggi, ma a volte presenta delle sfide che devono essere superate. I problemi riportati di seguito riguardano tutti gli strumenti Raman. Esistono soluzioni per sfruttare al meglio i sistemi Raman.
Ecco alcune soluzioni e consigli pratici.
1. L'effetto Raman è poco evidente
I sistemi Raman di Renishaw utilizzano un design ottico molto efficiente e rilevatori ultrasensibili.
2. Uno sfondo con fluorescenza intensa può nascondere le bande Raman
Con uno strumento dotato di più laser, è possibile cambiare la lunghezza d'onda di eccitazione. Ad esempio, il passaggio da una luce laser visibile a una nel vicino-infrarosso (ad esempio a 785 nm) solitamente si traduce in una riduzione dell'effetto indesiderato della fluorescenza. Questa tecnica accresce le probabilità di ottenere spettri con bande Raman chiaramente visibili.
3. Molti campioni hanno superfici che non sono piatte
In passato, era difficile eseguire l'imaging Raman su campioni con superfici irregolari. Ora, i microscopi Raman di Renishaw sono dotati di tecnologia LiveTrack, che mantiene automaticamente il fuoco durante la raccolta dati e aiuta a studiare le variazioni chimiche e strutturali in base alla topografia.
4. Le provette di vetro e i vetrini del microscopio possono nascondere le bande Raman dei campioni
a. Sostituire i vetrini con portacampioni in acciaio inox.
b. Nel caso delle cellule biologiche si possono utilizzare portacampioni levigati in acciaio inox, CaF2 o MgF2.
c. Utilizzare provette di quarzo che a 785 nm producono uno sfondo meno intenso del vetro.
5. Provette e substrati possono influenzare lo spettro
È possibile controllare il grado di confocalità del microscopio Raman confocale inVia™ e dell'analizzatore Raman Virsa™. Combinare un obiettivo con un'alta apertura numerica (NA) e un'impostazione molto confocale del microscopio, per ridurre al minimo il volume da campionare. Questo aiuta a controbilanciare eventuali sfondi indesiderati, prodotti dal substrato o dai materiali della provetta.
Per analizzare un campione consistente, posto in un contenitore trasparente, è possibile utilizzare una lente con una NA bassa per mettere a fuoco l'interno del contenitore. Anche questa tecnica consente di massimizzare il segnale Raman ottenuto dal materiale di interesse e di ridurre le interferenze spettrali del contenitore.
6. Laser molto potenti possono danneggiare i campioni
La diffusione Raman viene generata tramite laser. Il segnale Raman è proporzionale alla potenza del laser (maggiore la potenza, tanto più intenso è il segnale).
Ad ogni modo, tutti i campioni hanno una soglia di tolleranza alla densità di potenza del laser oltre la quale si possono verificare alterazioni strutturali o chimiche. Queste sono le nostre soluzioni:
a. Spettrometro con un design molto efficiente, per produrre segnali Raman intensi anche con laser a bassa potenza.
b. La potenza del laser viene controllata da un software ed è ripetibile, per avere la certezza che il campione non ha subito variazioni.
c. La potenza incidente del laser viene distribuita su un'area più vasta utilizzando una linea focale. Questa modalità è disponibile nei microscopi inVia, negli analizzatori farmaceutici RA802 e negli analizzatori biologici RA816.
7. Rimozione automatica dei raggi cosmici con il software WiRE™
I raggi cosmici sono particelle ad alta energia, provenienti dallo spazio esterno. Se i raggi cosmici colpiscono un rilevatore durante l'acquisizione dati, lo spettro mostrerà picchi di alta intensità. Spesso, le immagini Raman di grandi dimensioni contengono migliaia di artefatti prodotti da raggi cosmici.
Il software WiRE rimuove in modo completamente automatico i raggi cosmici dalle immagini Raman di grandi dimensioni e contenenti fino a 50 milioni di spettri. Questo permette di automatizzare il flusso di lavoro dell'analisi dati e di ottenere risultati affidabili.
La risoluzione spaziale dell'immagine Raman
Vi sono alcuni fattori che determinano la risoluzione spaziale di un microscopio Raman:
• Dimensioni del punto laser
Si tratta di una funzione dell'apertura numerica (NA) dell'obiettivo e della lunghezza d'onda del laser. In breve, un'apertura numerica alta e lunghezze d'onda brevi producono punti piccoli.
• La distanza fra i punti di acquisizione dello spettro sul campione (campionamento)
Questa è una funzione della base. La base codificata MS30 di Renishaw assicura velocità elevate e ha una corsa lunga, con incrementi ridotti, fino a 50 nm. Gli incrementi sono minori delle dimensioni del più piccolo punto laser limitato dalla diffrazione.
• La capacità di ingrandimento delle ottiche dello spettrometro e le dimensioni dei pixel CCD.
In pratica, l'intrinseca natura ondulatoria della luce la limita a una dimensione di poco inferiore al micrometro.
Le equazioni utilizzate per calcolare le dimensioni del più piccolo punto laser limitato dalla diffrazione di Abbe e il limite teorico della risoluzione laterale dell'obiettivo di un microscopio e la lunghezza d'onda della luce.
La spettroscopia Raman: approfondimento
Non conosci la spettroscopia Raman? Impara velocemente le nozioni base dell'analisi Raman.
Spettroscopia Raman amplificata dalla superficie (SERS)
La spettroscopia Raman amplificata dalla superficie può aumentare l'intensità della diffusione Raman dalle molecole adsorbite sui substrati SERS. I substrati SERS possono essere superfici metalliche ruvide o nanoparticelle metalliche colloidali. In alcuni casi l'aumento del segnale può essere di più di un miliardo di volte. SERS è in grado di rilevare concentrazioni di materiale bassissime ed è quindi una tecnica molto utile in settori quali biorilevazione e analisi forense.
Esistono due effetti che consentono di migliorare la diffusione Raman dalle molecole poste in prossimità del substrato SERS metallico:
• Il metallo può amplificare i campi elettrici della luce laser in arrivo e della luce Raman diffusa in uscita
• Il metallo può modificare la distribuzione delle cariche presenti nelle molecole assorbite, aumentando la diffusione
Spettroscopia Raman potenziata dalla punta (TERS)
La spettroscopia Raman potenziata dalla punta (TERS) è un tipo di SERS che si avvale di una punta rivestita in metallo per ottimizzare il segnale Raman. La tecnica TERS intensifica il segnale Raman prodotto da molecole poste a pochi nanometri dalla punta. Questo metodo è in grado di risolvere particelle con dimensioni a livello di nanometri. Per fare un confronto, la risoluzione spaziale limitata dalla diffrazione di una normale diffusione Raman a campo lontano è >0,2 μm.
La spettrometria TERS permette di ottenere imaging chimici con risoluzioni altissime, effettuando un confronto fra gli spettri ottenuti con e senza la punta in contatto. In genere, la punta TERS viene montata su un microscopio a scansione di sonda (SPM) o a forza atomica (AFM). Il microscopio Raman inVia di Renishaw può svolgere misure SPM/AFM in loco, anche con la tecnica TERS.
Renishaw fornisce funzionalità combinate Raman-SPM/AFM con opzioni TERS.
Immagine AFM di un fiocco di grafene con spettri Raman da campo lontano e misure TERS. Lo spettro Raman TERS risolve con facilità l'area ridotta del grafene a strato singolo. Lo spettro Raman a campo lontano ha una banda 2D più ampia, che indica un contributo da parte del grafene a doppio strato situato in prossimità.
Cosa si intende per spettroscopia Raman?
Continua il viaggio alla scoperta della spettroscopia Raman e a fotoluminescenza (FL), con informazioni utili sulla microscopia Raman, sull'imaging Raman rapido, sull'analisi dei dati, la fluorescenza e le tecniche di analisi complementari.
La spettroscopia Raman: approfondimento