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Cosa rivelano le immagini Raman

Le immagini Raman possono mostrare la distribuzione delle specie chimiche e strutturali presenti all'interno di un campione. Scopri come ottenere e analizzare le immagini Raman.

Le immagini Raman vengono definite anche mappe, perché mostrano la distribuzione spaziale delle informazioni spettrali del campione. Un microscopio Raman permette di raccogliere informazioni spettrali da una serie di punti posti su un campione o al suo interno. L'imaging Raman mostra chiaramente le variazioni nelle proprietà chimiche e strutturali con posizioni quali profili 1D, aree 2D o volumi 3D.

Quali informazioni si possono ottenere dalle le immagini Raman

L'utilizzo delle informazioni spettrali in ciascun pixel di un'immagine Raman consente di determinare:

  • la presenza di uno specifico materiale o specie chimica
  • la presenza di un materiale sconosciuto
  • la distribuzione del materiale o della specie
  • le dimensioni di ogni particella o dominio
  • la quantità relativa di materiali o specie chimiche
  • la variazione strutturale in un materiale, come ad esempio lo stato cristallino o tensionale
  • lo spessore (da micrometri a millimetri) e la composizione di materiali multi-strato, come ad esempio i laminati polimerici
Immagini in luce bianca e Raman di una polvere detergente

Immagini in luce bianca e Raman di una polvere detergente. Le immagini Raman mostrano domini chimicamente diversi che non sono visibili nell'immagine a luce bianca.

Imaging Raman qualitativo e quantitativo

Le immagini Raman con colori falsi rappresentano un modo eccellente per evidenziare la distribuzione delle proprietà chimiche e strutturali all'interno di un campione. La luminosità, il contrasto e il colore dell'immagine possono essere utilizzati per rappresentare la composizione del materiale. La sovrapposizione di immagini diverse consente di visualizzare contemporaneamente la distribuzione di più specie o proprietà.

Wafer SiC

Immagine Raman di un Wafer SiC. L'area dell'immagine è di circa 1 mm2e mostra inclusioni di carburo di silicone 6H, carburo di silicone 3C o Si (rosso), vuoti (nero). La distribuzione della tensione viene visualizzata con una colorazione che va dal blu al verde.

Immagine Raman binarizzata del montelukast sodico Immagine Raman di un API di montelukast sodico all'interno di una compressa. I domini dell'API hanno colorazioni diverse per agevolare la visualizzazione.

Le immagini Raman possono essere analizzate anche per ottenere dati quantitativi, ad esempio sulle metriche statistiche (numero, forma, dimensioni) delle particelle. In questo modo, le immagini Raman possono essere quantificate con metriche oggettive per effettuare confronti diretti.

Come vengono raccolte le immagini Raman

Si utilizza un microscopio Raman per acquisire spettri Raman da ciascuna posizione del campione. Successivamente, gli spettri Raman vengono salvati in un unico file di dati, denominato ipercubo spettrale che viene analizzato per produrre immagini Raman.


Sono disponibili diversi metodi di imaging Raman:


Punto focale
Il microscopio Raman focalizza il laser su un punto del campione. Il campione viene posto su una base motorizzata che lo porta sotto il laser. Lo spettrometro acquisisce gli spettri da una serie di punti nel campione.

Renishaw ha sviluppato le tecnologie StreamHR™ e StreamHR™ Rapide che consentono di ottenere velocemente immagini Raman a punto focale. Utilizzando StreamHR Rapide è possibile acquisire oltre 1.000 punti spettrali al secondo.

Campionamento ottimale e non ottimale



Diagramma di un imaging punto per punto, che mostra un campionamento ottimale e uno non ottimale.

Linea focale
Il laser illumina una linea sul campione, anziché un punto. Questo sistema consente di raccogliere simultaneamente spettri da più posizioni sul campione, con un significativo risparmio di tempo. Questo metodo permette di utilizzare laser con una potenza complessiva superiore, senza danneggiare il campione. La tecnologia di imaging StreamLine™ di Renishaw rappresenta un'implementazione sofisticata e moderna di questo concetto. Nell'imaging a linea focale, il laser illumina una linea verticale sul campione anziché un punto.


Durante l'imaging, è importante prendere in considerazione i possibili effetti indesiderati di un campionamento non ottimale. Questo si verifica quando il punto o la linea ha dimensioni minori rispetto alla distanza fra i punti di acquisizione. Renishaw ha ovviato al problema introducendo la tecnologia StreamLine con la modalità Slalom.

StreamLine™ Slalom

La tecnologia di imaging Streamline con modalità Slalom garantisce una copertura completa del campione, anche quando si utilizzando passi (pixel) ampi. In questo modo, è possibile svolgere imaging Raman rapidi senza perdere nessun dato.

Tecnologia StreamLine per imaging Raman rapido e delicato

Il sistema scansiona la linea laser sul campione, lungo l'asse Y. Il rilevatore CCD raccoglie simultaneamente dati da più punti posti sul campione.

La dimensione del passo su X è uguale alla larghezza della linea del laser. Questo metodo assicura una copertura completa, ma non è rapidissimo.

Campionamento non ottimale senza la modalità Slalom

La dimensione del passo su X è maggiore della larghezza della linea del laser. La linea del laser non esegue la scansione fra i pixel, quindi lo spettrometro non è in grado di analizzare alcune aree. Nella figura, il sistema acquisisce dati relativi solo al ~20% del campione.

Tecnologia Streamline con modalità Slalom per una copertura rapida e completa

Il movimento a zig-zag della linea del laser scansiona le aree del campione poste fra i pixel. Questo consente di usare una dimensione del passo su X maggiore della larghezza della linea del laser.

Ora lo spettrometro può acquisire il 100% del campione a velocità sostenuta.

Colon di un ratto





Immagine Raman che mostra l'organizzazione dei tessuti del colon di un ratto sano. L'immagine è stata creata con PCA.

Come analizzare le immagini Raman

Gli spettri Raman di un'immagine possono essere analizzati per ricavare profili 1D, immagini 2D o volumi 3D renderizzati. L'immagine Raman potrebbe mostrare parametri di banda semplici e univariati, come, ad esempio, l'intensità di una banda Raman. In alternativa, è possibile usare un'analisi completa e multivariata dell'intero spettro Raman lungo l'ipercubo spettrale.


Il software WiRE™ di Renishaw presenta molte opzioni per l'analisi dei dati raccolti tramite l'imaging Raman:

Intensità su una frequenza dello spettro
Le immagini vengono generate rapidamente, ma possono risultare fuorvianti. Questo metodo non è in grado di riconoscere le intensità prodotte dalla banda Raman di interesse e quelle associate a una più ampia fluorescenza di fondo.

Parametri "curve-fit"
In ciascuno spettro di un'immagine Raman è possibile inserire una curva teorica per ciascuna banda Raman. Si possono quindi calcolare vari parametri della banda, come ad esempio lo scostamento Raman, la larghezza della banda o l'intensità relativa. Spesso, le immagini Raman mostrano variazioni nello scostamento Raman di una banda, che possono indicare una tensione localizzata. Inoltre, possono evidenziare variazioni nella larghezza della banda Raman, indici di gradi diversi di cristallinità.

Parametri multivariati
L'analisi multivariata è uno strumento molto efficace, perché sfrutta le informazioni contenute nell'intero spettro e non solo quelle provenienti da un solo parametro (ad esempio l'intensità su una singola frequenza o una banda di curve-fit). Di conseguenza, produce immagini Raman di alta qualità e con una migliore specificità chimica.

Se si dispone di spettri di riferimento per i componenti chimici contenuti nel campione, non sarà difficile creare immagini Raman che ne evidenzino la distribuzione. In questi casi, si consiglia di utilizzare metodi di analisi dei componenti, quali DCLS (minimi quadrati classici diretti) o NNLS (minimi quadrati non negativi). I metodi di analisi dei componenti possono essere utilizzati per ottenere stime sulle concentrazioni quantitative.

Se non fossero disponibili spettri di riferimento, si possono creare immagini Raman utilizzando metodi chemiometrici non supervisionati, come, ad esempio, analisi dei cluster, analisi del componente principale (PCA) oppure la funzione software EmptyModelling™ di Renishaw. I metodi chemiometrici possono essere utilizzati anche quando non si conosce la composizione del campione, perché analizzano la varianza sistematica fra gli spettri Raman per fornire previsioni sui componenti spettrali. A questo punto, un'immagine Raman mostrerà la distribuzione dei componenti spettrali nel campione.

Analisi spettrale e PCA vengono utilizzati frequentemente per analizzare le immagini Raman di cellule e tessuti organici. Questi metodi chemiometrici sono molto potenti e permettono di individuare strutture all'interno di campioni biologici, che spesso non contengono elementi biochimici puri.

La funzione EmptyModelling è una versione molto più intuitiva dell'analisi MCR-ALS (risoluzione multivariata delle curve ai minimi quadrati alternati). Questo metodo consente di creare immagini Raman dei campioni in cui vengono identificate regioni sconosciute di componenti puri. Si tratta di informazioni importanti, soprattutto nel caso di campioni quali wafer di semiconduttori o formulazioni farmaceutiche.

Tutte queste funzioni avanzate di analisi dati sono incluse nel pacchetto chemiometrico del software WiRE e possono essere utilizzate immediatamente senza nessuna programmazione.
 

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